《细胞》重磅：中国科学家解开男性精子异常不育症的基因谜团，意义非凡！

　　日前，《细胞》杂志上刊登了中科院上海生化与细胞所刘默芳研究员团队的研究，他们首次证明了一个基因的突变是如何导致男性精子异常不育症的，而且还为这类不育症的治疗提供了理论基础和可参考的方法[1]！

刘默芳研究员（右）在实验室中工作

什么基因如此重要？它就是Piwi基因（人的Piwi基因称为Hiwi）。Piwi最早是在果蝇卵巢中被发现的[2]，对干细胞分裂有调控作用，并且能够维持生殖细胞细胞分裂的稳定性[3]，它所编码的Piwi蛋白能够与雄性动物睾丸内的一种小RNA结合，因此，这种小RNA就被称为piRNA[4]。这对儿“couple”对生殖细胞基因表达的调控起着非常重要的作用。

早在2013年，刘默芳研究员的团队就在小鼠模型中发现了一系列和piRNA/Piwi（小鼠的Piwi基因称为Miwi）相关的有趣的现象和机制[5]。首先，如果想要精子正常形成，那么Miwi蛋白就要在精子形成的后期阶段被降解，否则精子就会“不正常”或是“半路夭折”。

其次，Miwi的降解需要一个酶——APC/C，但是大家要记住，它的降解首先得经过一个“泛素化修饰”的过程。泛素化修饰是什么呢？其实它是一种很常见的内源蛋白降解的方式，蛋白要与酶的一个成分先结合，然后才能被酶降解，但是也并不是所有的泛素化修饰都会引起蛋白降解。

最后，piRNA隆重登场，它在这其中扮演了一个“重要而悲情的角色”，因为它能够促进Miwi与APC/C的结合，帮助Miwi降解，但同时，Miwi是精子形成后期中唯一一个能与piRNA结合的蛋白，一旦Miwi被降解，失去了结合蛋白保护的piRNA也会迅速被清除。所以，这大概是个“帮助外人解决了自己couple然而自己也不能活命”的悲惨故事。

在这个系列故事里我们不禁要问，Miwi不能被成功降解的时候，问题是出在哪里呢？根据当年的研究结果，问题就出在了“泛素化修饰”这个环节上！

通过观察，研究人员发现，在Miwi的编码基因中，存在一个D-box（destruction box）序列，很久以前的研究证明，D-box序列对应的蛋白就是与我们前面提到的，酶的一个成分结合的关键区域[6]。也就是说，D-box应该就是决定了泛素化修饰是否成功的重要序列。

经过鉴定，研究人员确定了D-box序列上的突变会导致泛素化修饰被减弱或是完全消除。这就意味着，piRNA/Piwi这对儿couple没有被双双“干掉”，滞留在了精子细胞中，那么这就不能形成正常的精子了。

人的Piwi序列碱基组成

当年在小鼠身上的实验就这样结束了，那么这个机制在人的身上是否同样适用呢？这次的新研究给了我们答案。他们招募了413名无精症男性和300名至少有一个孩子的正常男性，然后对他们的Hiwi基因上D-box序列进行了测序，结果在3名无精症男性的D-box序列上发现了几个突变，而这些突变在300名正常男性中是完全不存在的。

因为当年在小鼠体内的实验是“倒推法”找到了D-box序列，因此，这一次，研究人员决定要“正推”一下，直接按照测序的结果构建D-box突变小鼠模型，验证它们是否是精子异常型不育的原因。实验结果显示，经过“改造”的小鼠的精子果然“不对劲儿”了！它们不仅数量少，而且精子中染色质也少，精子头部还多呈弯曲状态。

不同阶段上精子形成的数量，蓝色为正常小鼠，红色为D-box突变型小鼠

可能有人会问，头部弯曲怎么了？事实上，这是一种“精子畸形”。正常精子头部应该呈前窄后宽的卵圆形，轮廓规则，最前方有清楚透亮的像“帽子”一样的顶体（特化的溶酶体，在与卵子“相撞”时释放顶体酶，“解除”卵子的“抵抗”，帮助精子顺利进入卵子内）。对照我们下面的对比图，大家应该就明白了。

正常精子（左）与D-box突变的精子（右）对比，右上图中黑色尖头所指均为显微镜视野内的畸形精子

那么，问题又来了，精子的正常结构是如何形成的？其实每一颗精子都是非常辛苦的，因为它们竞争对手众多，而且路途遥远，一路从阴道到子宫再进入输卵管，在输卵管中遇到卵子后还要穿过卵子透明带等各种屏障，最终才能成为卵子唯一的“裙下之臣”。

为了让自己变得“更强”，精子结构在形成时会出现一个独特的表观遗传学调控——组蛋白被鱼精蛋白替换。鱼精蛋白能够代替组蛋白与精子中的DNA结合，形成染色质高度浓缩、状态稳定的DNA-鱼精蛋白复合体，并且还会以我们难以想象的方式将自己“安置”在一个极小的空间内，形成精子细胞核[7]。这种变化能够让精子更加“灵活”，也保护精子携带的遗传物质不被雌性体内的种种“障碍”破坏。

精子的形成过程，紫色为细胞核，可以看到细胞核逐渐“浓缩”的过程

所以组蛋白被鱼精蛋白替换是如何发生的呢？这是2010年的时候，密歇根大学医学院的研究人员发现的，他们在研究中证明，只有组蛋白中H2A和H2B这两种发生泛素化修饰之后，替换才能发生，而H2A和H2B的泛素化需要一个连接酶——RNF8介导[8]。

在这样的前提下，研究人员迅速联想到，既然这种替换是精子正常结构形成的“必经之路”，而2013年的研究又证明了D-box突变能干扰泛素化修饰，所以是不是D-box的突变影响了H2A和H2B组蛋白的泛素化修饰才导致了精子的畸形呢？

为了验证这个想法，他们首先对那些改造后精子畸形小鼠的组蛋白泛素化修饰进行了检测，发现泛素化水平果然降低了！进一步的实验表明，之所以泛素化水平降低是因为D-box突变导致精子细胞中的Miwi蛋白没有被降解，而Miwi蛋白可以和RNF8结合，结合后RNF8就无法按照“原定计划”进入细胞核，介导H2A和H2B组蛋白的泛素化修饰了！看到这里，大家应该就明白了为什么改造后的小鼠的精子大都是畸形的了。

从D-box突变到精子异常的发展途径

最后，研究人员想有没有什么办法能阻止这一“悲剧”的发生呢？于是他们尝试了将能和Miwi蛋白结合的，RNF8上的一段RNF8-N肽用载体转进了小鼠体内。结果显示，RNF8-N肽顺利地与精子中“滞留”的Miwi蛋白结合，而其余的RNF8就“逃过一劫”，像正常发育时一样进入了精子细胞核中，由此产生的精子形态恢复了正常，而且研究人员还观察到了它们能正常地“游动”。也就是说，这种方法“拯救”了无精症小鼠！

总的来说，这项研究为我们揭示了由Piwi基因突变到精子异常型不育的“蝴蝶效应”，而且还验证了一种“干预手段”，尽管这一手段还只是在小鼠体内适用。我们也希望研究能早日进入临床，造福广大有困扰的夫妻！

参考文献：

[1] Gou L.T, et, al. Ubiquitination-Deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histone-to-Protamine Exchange during Spermiogenesis. Cell. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.034

[2] Lin H, Spradling AC (1997). "A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary". Development. 124(12): 2463–2476.

[3] Cox DN, Chao A, Lin H (2000). "piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activity modulates the number and division rate of germline stem cells". Development.127 (3): 503–14.

[4] Aravin A, Gaidatzis D, Pfeffer S, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes[J]. Nature, 2006, 442(7099): 203-207.

[5] Zhao S, Gou L T, Zhang M, et al. piRNA-triggered MIWI ubiquitination and removal by APC/C in late spermatogenesis[J]. Developmental cell, 2013, 24(1): 13-25.

[6] Glotzer M, Murray A W, Kirschner M W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway[J]. Nature, 1991, 349(6305): 132.

[7] Yanagimachi R. Male gamete contributions to the embryo[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, 1061(1): 203-207.

[8] Lu L Y, Wu J, Ye L, et al. RNF8-dependent histone modifications regulate nucleosome removal during spermatogenesis[J]. Developmental cell, 2010, 18(3): 371-384.

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